恩诺沙星(ENR)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒
本试剂盒仅供研究使用。
使用目的：
本试剂盒用于饲料、鱼、虾和肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉），鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿样中中恩诺沙星(ENR)残留的定量检测。
实验原理
本试剂盒采用竞争ELISA方法，在微孔板包被有恩诺沙星(ENR)偶联抗原，加入恩诺沙星(ENR)标准品或样品，游离恩诺沙星(ENR)与微孔条上预包被的恩诺沙星(ENR)偶联抗原互相竞争抗恩诺沙星(ENR)抗体酶标记物，用TMB底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中恩诺沙星(ENR)含量成反比，通过标准曲线计算样品中恩诺沙星(ENR)的含量。
一、试剂盒组成
1. 预包被的恩诺沙星(ENR)偶联抗原的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。
2. 恩诺沙星(ENR)标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：0ng/ml, 1ng/ml，3ng/ml ,9ng/ml ppb,27ng/ml,81ng/ml。
3. 抗恩诺沙星(ENR)）抗体酶结合物：1瓶（6ml）。
3. 显色液A：1瓶（6ml）。
4. 显色液B：1瓶（6ml）。
5. 终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
6. 样本稀释液：1瓶（10×, 6ml），用于样品稀释用。
7. 浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
8. 说明书一份。
二、需要而未提供的材料
1. 设备
2. 波长450nm酶标仪。
3. 粉碎机。
4. 量筒。
5. 振荡器。
6. 漏斗。
7. Whatman No 1或相当的滤纸。
8. 微量移液器。
9. 试剂
10. 去离子水或蒸馏水。
11. 甲醇。
12. 贮存
13. 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻
14. 未用完的微孔板应该密封干燥保存
三、注意事项
1. 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
2. 不要使用过期试剂盒。
3. 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。
4. 标准品中含有恩诺沙星(ENR)，使用时应特别注意，操作时应戴手套。
5. 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。
6. 不同标准品、样品所用洗头不能混用，否则会影响试验结果。
7. 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用洗头不得混用，否则会影响实验结果。
8. 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果
9. 混合试剂时应避免起泡。
四、工作液准备
1. 恩诺沙星(ENR)）标准品溶液：0ng/ml, 1ng/ml，3ng/ml ,9ng/ml ppb,27ng/ml,81ng/ml
2. 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用
3. 样本稀释液：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用
4. 显色剂：已备用，避免光线直照
5. 反应终止液：已备用
五、样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）
1. 取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液
2. 强力振荡3分钟
3. 用Whatman No 1滤纸过滤
4. 取25μl处理后的样品，加入25μl样本稀释液于反应孔中（样本稀释倍数为2）
六、酶免分析步骤
1. 实验须知
2. 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。
3. 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存
4. 请不要改变分析程序
5. 请使用精确的微量移液器
6. 操作一旦开始，请不要中断任何程序
7. ELISA结果的可重复性极大程度地取决于操作程序，请严格按照要求操作
8. 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样
9. 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面
七、分析步骤
1. 预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测
2. 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存
3. 样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释)
4. 在B0孔中加入50μl 0.0 ng/ ml标准品溶液
5. 在各标准孔中加入50μl的标准品溶液
6. 在各样品孔中加入50μl样品溶液
7. 在所有孔中加入50μl的抗恩诺沙星(ENR)抗体酶结合物
8. 轻轻晃动反应板几秒钟。
9. 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）
10. 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
11. 反应
12. 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50μl显色液A，再加 50μl显色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀
13. 37℃温浴10min
14. 每孔中加入50μl终止液，混匀
15. 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。
八、结果计算
1. 定量分析
2. 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ ml标准溶液的平均吸光度值
3. 以恩诺沙星(ENR)浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为恩诺沙星(ENR)浓度的对数值，求得反对数即为测定液中恩诺沙星(ENR)浓度C（ng/ml）
4. 由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。
5. 半定量测定
6. 目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
7. 仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
九、特异性
物质 交叉反应
恩诺沙星(ENR) 100%
十、试剂盒参数
本试剂盒检测下限为0.05 ng/ml
B0吸光度最佳值应大于1.0
试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。
用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。
试剂盒提供的标准曲线范围为0.1ng/ml~100ng/ml。
十一、分析限制
本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。
