ELISA试剂盒(酶联免疫分析测试法)实验操作中常见问题分析（二）

三、操作技术的影响

操作过程的控制：

1. 严格按照试剂说明书进行操作。操作前将试剂在室温下平衡30～60min。

2. 加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗che底。

3. 封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板"的出现。

4. 用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板"的出现。

5. 合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。

6. 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

7. 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。

8. 加样时保持显色剂不外流;A、B液应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。

9. 应保证C清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施可以使“花板"降至zui低限度。从而提高检测的特异性。并得到更准确、可靠的实验结果。

   加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。加样时应将所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。

   温浴影响，在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原 抗体 反应一般在37℃经1-2 小时，产物的生成可达ding峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的 试剂 盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。

   另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。96孔酶标板结构特别;易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异;干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。

   洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是zui主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。

   洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，各种 试剂 盒的洗液不要混用。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。

   洗液需要稀释，应按要求稀释。配制洗液应用新鲜的和高质量的纯化水，电导率小于1.5μs/cm，洗液如果结晶应待其融解后配制。手洗条件一致性较差，对结果影响较大，防止洗液在孔内形成气泡。半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不che底，导致“花板"造成假阳性或假阴性;所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。